Nghiên cứu sự biểu hiện gen chống chịu chì (Pb) của cây phát tài (Dracaena sanderiana) trong điều kiện nhiễm độc chì
Đây là nhiệm vụ khoa học và công nghệ cấp cơ sở của Ths. Hồ Bích Liên, trường Đại học Thủ Dầu Một thực hiện với mục tiêu xác định mức độ biểu hiện gen chống oxy hóa của cây phát tài trong điều kiện nhiễm độc chì; xác định tiềm năng tích lũy và phân bố chì trong các cơ quan rễ, thân và lá của cây phát tài.
Các trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu là nồi hấp tiệt trùng, máy cất nước, tủ sấy, tủ lạnh -20oC, tủ -70oC, tủ cấy vô trùng, máy lắc ổn nhiệt, bể ổn nhiệt, máy đo pH, máy ly tâm, cân điện tử, lò vi sóng, máy đo UV-Vis (Biotek, Mỹ), máy PCR, hệ thống máy Applied Biosystem®7500 Real-time PCR. Các dụng cụ cho nghiên cứu bao gồm micropipette, đầu tip, tube, đèn cồn, đĩa petri, ống falcon, ống nghiệm, que cấy, chày cối sứ, máy quang phổ hấp thu nguyên tử AAS.
Các mẫu cây phát tài (Dracaena sanderiana Sander) được trồng và xử lý với chì tại vườn thực nghiệm, Trường ĐH Thủ Dầu Một. Các cây trưởng thành có thời gian sinh trưởng như nhau, kích thước đồng đều, chiều cao khoảng 45 cm, được chọn và trồng trong nước khử ion bổ sung Pb(NO3)2 nồng độ 1000 ppm và được chuẩn độ pH4,5.
Mẫu lá, thân và rễ cây phát tài được thu nhận tại thời điểm 0, 2 và 24 giờ sau khi xử lý với Pb(NO3)2 (thời điểm sớm và muộn do ảnh hưởng của stress) với 3 lần lặp lại. Mẫu cây không xử lý Pb được sử dụng làm đối chứng. Các mẫu được thu nhận và nghiền nhanh trong nitơ lỏng và bảo quản ở -70oC.
Số liệu được ghi nhận bằng chương trình Microsoft Excel 2010, tỷ lệ biểu hiện gen được tính là tỷ số giữa log số bản copies ở mẫu thí nghiệm xử lý chì với log số bản copies ở mẫu đối chứng không xử lý chì. Tỷ lệ biểu hiện của các gen chống oxy hoá được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV 15.1.02. Phân tích ANOVA được tiến hành, sau đó kiểm tra trắc nghiệm phân hạng bằng trắc nghiệm LSD với mức xác suất có ý nghĩa P = 0,05 hoặc 0,01.
Kết quả, sản phẩm khuếch đại từ các cặp primer GPX, SOD và GST cho băng có kích thước lần lượt là khoảng 200, 120 và 120 bp so với thang chuẩn, điều này đúng với lý thuyết dự kiến các sản phẩm khuyếch đại từ các cặp primer GPX, SOD và GST lần lượt là 202, 121 và 121 bp. Sản phẩm PCR mẫu chứng âm (mẫu nước khử ion) không xuất hiện băng sản phẩm kích thước trên 100 bp.
Việc chọn lọc các dòng tế bào E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp (E. coli DH5α - pGEM-T Easy - GST/SOD/GPX) tiến hành bằng phương pháp PCR khuẩn lạc. Chọn khuẩn lạc có màu trắng mọc rời và có hình thái đặc trưng trên đĩa thạch LB (Ampicillin/X-gal/IPTG) để kiểm tra bằng PCR (mỗi loại vector tái tổ hợp chọn 2 khuẩn lạc). Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc là băng có kích thước tương đương với kích thước sản phẩm PCR gen chống oxy hoá GST và SOD là 121 bp và 202 bp ở gen GPX, chứng tỏ plasmid mang gen chống oxy hoá đã được chuyển thành công vào vi khuẩn E. coli DH5α.
Các đường chuẩn có độ tuyến tính cao (R2>0,99), điều này có nghĩa có mối tương quan tuyến tính khá chặt chẽ giữa log số bản copy của gen chống oxy hoá ban đầu và số chu kỳ ngưỡng Ct trong ba phương trình đường chuẩn, có y là giá trị Ct và x là log số bản copy gen đích. Các mẫu cDNA rễ, thân, lá cây phát tài xử lý với Pb và mẫu đối chứng không xử lý Pb được định lượng từ phản ứng Real-time PCR.
Sự biểu hiện gen SOD trong mỗi bộ phận cây (rễ, thân và lá) đã có sự thay đổi sau 24 giờ xử lý so với đối chứng. Tỷ lệ biểu hiện gen trung bình giữa thời điểm 0 giờ và thời điểm 2, 24 giờ sau xử lý Pb có sự khác biệt rõ rệt có ý nghĩa ở mức 0,01.
Tỷ lệ biểu hiện gen GPX ở tất cả các mẫu cây phát tài ở thời điểm 2 giờ tăng có khác biệt với thời điểm 0 giờ, gen GPX của cây phát tài đã có sự tăng biểu hiện đáp ứng Pb sau 2 giờ xử lý. Ở mỗi bộ phận, rễ, thân và lá, tỷ lệ biểu hiện gen lần lượt tăng là gấp 1,72 lần, 1,27 lần và 1,11 lần so với đối chứng. Các tỷ lệ biểu hiện gen giữa các bộ phận có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 0,05 (ở lá) và 0,01 (ở thân và rễ)...
Qua nghiên cứu cho thấy, các gen chống oxy hoá là SOD, GPX và GST đều tăng cường biểu hiện so với đối chứng ở cả ba bộ phận rễ, thân và lá cây Phát tài sau khi xử lý Pb(NO3)2 từ 2 đến 24 giờ. Sự thay đổi biểu hiện các gen khác nhau giữa các bộ phận của cây trong cùng điều kiện xử lý là khác nhau. Gen GPX và GST đều tăng cao ở mẫu rễ hơn ở thân và lá, còn gen SOD thì mức độ biểu hiện nhiều ở mẫu thân, vậy có sự khác nhau của từng gen chống oxy hoá trong việc đáp ứng với Pb ở các bộ phận cây phát tài trong cùng một điều kiện xử lý.
Kết quả nghiên cứu góp phần chứng tỏ các gen chống oxy hóa có vai trò quan trọng trong cơ chế đáp ứng với môi trường nhiễm độc chì của cây phát tài, có thể là cơ sở ứng dụng đánh giá khả năng chống chịu stress chì của cây Phát tài nói riêng và các loài thực vật khác. Cây phát tài có khả năng hấp thu và tích lũy chì trong các bộ phận rễ, thân và lá. Hàm lượng chì tích lũy cao nhất ở rễ đến thân và thấp nhất ở lá và tăng theo thời gian tiếp xúc chì.
Mỹ Linh