a. Tên luận văn: Phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae từ các hạt ngũ cốc có khả năng sinh tổng hợp gamma-aminobutyric acid (GABA) và thử nghiệm sản xuất GABA từ nấm mốc phân lập được
b.Họ và tên cá nhân thực hiện luận văn: Nguyễn Minh Thông
c. Tên đơn vị công tác: Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình Dương
d. Kết quả nghiên cứu (tóm tắt)
Gamma-aminobutyric acid (GABA) là một acid amin phi protein 4C, có chức năng quan trọng trong hệ thống thần kinh, thực hiện vai trò cơ bản trong quá trình truyền tín hiệu thần kinh. Ngoài ra, GABA đã được biết có hiệu quả điều hòa một số rối loạn thần kinh giống như bệnh Parkinson, Huntington và Alzheimer.
Hiện nay, có nhiều phương pháp sản xuất GABA như tách chiết từ các loại ngũ cốc, tạo điều kiện tối ưu để hạt gạo nảy mầm, ủ trà, lên men đậu tương bằng vi sinh vật. Trong đó, quá trình sản xuất GABA nhờ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men và nấm mốc) đang được ứng dụng rộng rãi.
Một trong những nấm mốc được lựa chọn nghiên cứu và ứng dụng để sản xuất thực phẩm lên men cổ truyền (chao, tương, nước tương, Koji,…) ở Việt Nam và các nước châu Á là chủng nấm Aspergillus oryzae (A. oryzae). A. oryzae có khả năng tiết ra nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó có enzyme GAD. Ngoài ra, A. oryzae được Tổ chức Y tế thới giới (World Health Organization - WHO) cho rằng, GABA sản xuất từ nấm A. oryzae là thực phẩm chức năng an toàn ở quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn còn ít và chưa có một dữ liệu xác định chủng A. oryzae được phân lập từ các hạt đậu có khả năng sinh tổng hợp GABA. Trước tình hình thực tiễn trên, đề tài: “Phân lập nấm mốc A. oryzae có khả năng sinh tổng hợp GABA từ các hạt đậu và thử nghiệm sản xuất GABA từ nấm mốc phân lập được” đã được thực hiện.
Mục tiêu của đề tài: “Phân lập nấm mốc A. oryzae có khả năng sinh tổng hợp GABA từ các hạt đậu và thử nghiệm sản xuất GABA từ nấm mốc phân lập được” là phân lập các chủng nấm mốc A. oryzae từ các hạt đậu và sản xuất GABA từ nấm mốc A. oryzae phân lập được trong môi trường cám gạo, đồng thời so sánh hàm lượng GABA sinh ra khi xử lý và không xử lý sóng siêu âm sau khi nuôi cấy.
Công thức phân tử của GABA: C4H9NO2
Công thức cấu tạo của GABA: .bmp)
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: được tiến hành tóm tắt trong Hình 1.
Chúng tôi đã tiến hành phân lập nấm mốc A. oryzae trên 5 loại hạt đậu được mua từ chợ Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương và chợ Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh. Bào tử nấm mốc sau phân lập được nuôi trên môi trường PDA trong 5 ngày (ở nhiệt độ phòng) được cấy (104 tế bào/ml) vào trong 100 ml dịch nuôi cấy đã được tiệt trùng, có pH 5,5 và ủ ở 37oC trong 3 ngày. Dịch lọc sau nuôi cấy được lọc bằng giấy lọc What-man và được phân tích hàm lượng GABA trong khi hệ sợi nấm được giữ lại để tiếp tục thử nghiệm ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hàm lượng GABA với biên độ sóng được khảo sát 20, 40 và 60%. Tiếp theo tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng (pH, nhiệt độ, nồng độ MSG) đến quá trình sinh tổng hợp GABA trong môi trường nuôi cấy chìm với dịch cám gạo từ chủng nấm mốc đã được chọn với thời gian lên men là 3 ngày. Cuối cùng, thử nghiệm việc sản xuất GABA từ A. oryzae với các thông số thu được.
Hình 1. Sơ đồ nghiên cứu
KẾT QUẢ:
1. Kết quả phân lập nấm mốc: đã phân lập được 1 chủng nấm mốc A. oryzae có khả năng tạo GABA với hàm lượng 35,05 µg/ml trong môi trường nuôi cấy chìm (tỉ lệ hỗn hợp phản ứng (w/v) gồm: 5% glucose, 0,4% L-glutamic acid, 0,1% MgSO4.7H2O, 0,15% KH2PO4, 0,6% yeast extract và 0,2% CaCl2.2H2O, 0,01% PLP, với đệm citrate có pH 5,5 trong 3 ngày ủ lắc 200 rpm, 37°C).
Hình 2. Hình dạng khuẩn lạc phân lập từ hạt đậu nành sau 4 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA Hình 3. Hình dạng bào tử, cuống phát sinh bào tử, bọng bào tử, thể bình của chủng nấm mốc A. oryzae phân lập được
2. Ảnh hưởng của việc sử dụng sóng siêu âm đến khả năng biến đổi GABA trong môi trường nuôi cấy chìm của nấm mốc A. oryzae
Việc sử dụng biên độ sóng 40% (so với các biên độ sóng 20% và 60%), công suất 50W, tần số 20kHz, số sóng (pulser) 50% là tốt nhất để phá vỡ tế bào nấm, thu enzyme GAD có hoạt tính cao, giúp cho quá trình biến đổi thành GABA có hàm lượng cao hơn không xử lý sóng 3,9 lần sau khi ủ 3 giờ.
.bmp)
Hình ảnh của sợi nấm từ A. oryzae sau khi phá vỡ tế bào dưới kính hiển vi với độ phóng đại x10. (a) Sau khi phá vỡ tế bào ở biên độ 20%; (b) 40%; (c) 60%
3. Ảnh hưởng pH môi trường đến hàm lượng GABA (µg/ml)
Kết quả cho thấy khi tăng pH dung dịch lên men từ pH 4,0 đến pH 5,5 thì hàm lượng GABA đều tăng lên, cụ thể hàm lượng GABA tăng từ 43,953 (µg/ml) lên 54,806 (µg/ml). Tuy nhiên, khi pH dung dịch lên men thay đổi từ 5,5 đến 6,0 thì hàm lượng GABA lại giảm có ý nghĩa. Như vậy, xét về hiệu quả kỹ thuật chọn pH lên men là 5,5 với đệm citrate để thực hiện cho các thí nghiệm tiếp theo.
4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hàm lượng GABA (µg/ml)
Kết quả cũng cho thấy tác động của yếu tố nhiệt độ đến hàm lượng GABA. Khi tăng nhiệt độ từ 31oC đến 37oC hàm lượng GABA tăng và đạt cực đại 55,530 (µg/ml) sau đó khi tăng tiếp nhiệt độ nuôi cấy thì hàm lượng GABA lại giảm xuống. Như vậy, xét về hiệu quả kỹ thuật, lựa chọn nhiệt độ lên men là 37oC làm yếu tố cố định khi tiến hành thí nghiệm thăm dò tiếp theo.
5. Ảnh hưởng của nồng độ % MSG (w/v) đến hàm lượng GABA (µg/ml)
Khi tăng % MSG trong dung dịch lên men từ 0,4% đến 0,8% thì hàm lượng GABA đều tăng lên, cụ thể hàm lượng GABA tăng từ 40,908 (µg/ml) lên 55,296 (µg/ml). Tuy nhiên, khi nồng độ MSG thay đổi từ 0,8% đến 1,0 % thì hàm lượng GABA tăng và từ 1,0% đến 1,2% thì hàm lượng GABA lại giảm nhưng mức tăng hoặc giảm này lại không có ý nghĩa. Với dịch cám gạo trong nghiên cứu của chúng tôi, nồng độ bổ sung MSG là 0,8% (w/v) là có ý nghĩa mặc dù ở nồng độ 1,0% hàm lượng GABA sinh ra cao hơn 0,8%, vì không có ý nghĩa.
6. Xử lý sóng siêu âm sau khi nuôi cấy chìm nấm mốc A. oryzae sinh GABA trong môi trường dịch cám gạo
Dịch cám gạo sau khi lên men 3 ngày với các thông số đã được khảo sát (pH, nhiệt độ, nồng độ % MSG) được tiến hành xử lý sóng siêu âm với các thông số được chọn như sau: công suất 50 W, tần số 20 kHz, số sóng (pulser) 50%, thời gian sử dụng sóng 15 phút với chu kỳ làm việc 30 giây hoạt động và 30 giây ngừng hoạt động trong bể đá lạnh (theo Yeng và cộng sự, 2013) và biên độ sóng 40% (theo kết quả khảo sát tại 2). Hỗn hợp sau khi xử lý được ủ trong 3giờ với nhiệt độ 37oC.
Kết quả cho thấy sau khi xử lý dịch nuôi cấy nấm mốc A. oryzae bằng sóng siêu âm cho hàm lượng GABA cao hơn, 133,02 µg/ml, so với không xử lý, 55,78 µg/ml.
KẾT LUẬN
Qua quá trình nghiên cứu chúng tôi có kết luận sau:
1. Phân lập và làm thuần được 05 chủng nấm mốc Aspergillus từ các hạt đậu, khi định danh 5 chủng nấm mốc trên được 01 loài A. oryzae.
2. Loài A. oryzae được phân lập được từ các hạt đậu ở Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp GABA trên môi trường nuôi cấy chìm với hàm lượng GABA thu được sau 3 ngày nuôi cấy là tương đối thấp, khoảng 35,05 µg/ml.
3. Dưới tác động của sóng siêu âm với biên độ 40% và thời gian ủ 3 giờ cho hàm lượng GABA cao hơn so với không xử lý sóng siêu. Do đó, việc xử lý phá vỡ tế bào nấm mốc sau lên men bằng sóng siêu âm để thu được hàm lượng GABA cao được áp dụng trong thí nghiệm nuôi cấy nấm mốc trên dịch cám gạo để biến đổi thành GABA.
4. Việc sản xuất GABA ở quy mô phòng thí nghiệm đạt hàm lượng cao nhất khi nuôi cấy nấm mốc A. oryzae phân lập được trong dịch cám gạo với pH 5,5, nhiệt độ nuôi cấy là 37oC và nồng độ MSG bổ sung vào dung dịch là 0,8% (w/v).
5. Việc xử lý sóng siêu âm đã mang lại hàm lượng GABA cao.
g. Năm tốt nghiệp: 2015
(Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo luận văn tại Trung tâm Thông tin và Thống kê khoa học và công nghệ).